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Presens感測器插頭在微流體中的應用

點選次數·₪☁↟│:401 釋出時間·₪☁↟│:2022-08-25

在這項研究中╃▩╃,我們假設感測器系統可用於小膠質細胞代謝的無創實時監測╃▩╃,以進一步闡明動態微環境下特定表型的極化水平₪▩✘₪•。我們設計並製造了一種微流控晶片╃▩╃,用於在連續流動下培養小膠質細胞╃▩╃,並將氧氣和 pH 值的變化與啟用後的極化狀態相關聯₪▩✘₪•。

炎症是由外來抗原••、病原體和化學物質等刺激引發的一系列複雜事件₪▩✘₪•。它在多種疾病中發揮關鍵作用╃▩╃,例如自身免疫性疾病••、癌症和傷口癒合過程 [1]₪▩✘₪•。巨噬細胞和小膠質細胞由於其抗原呈遞••、吞噬作用和免疫調節特性而分別在炎症和神經炎症中發揮重要作用 [2]₪▩✘₪•。小膠質細胞作為巨噬細胞的一種亞型╃▩╃,在神經免疫反應中也像巨噬細胞一樣發揮作用 [3]₪▩✘₪•。根據它們在生理微環境中暴露的訊號╃▩╃,小膠質細胞可以轉化為兩種不同的表型╃▩╃,稱為 M1 和 M2 [4]₪▩✘₪•。也稱為“經典啟用”的促炎 M1 小膠質細胞可以由脂多糖 (LPS) 誘導╃▩╃,而 IL-4 和 IL-13 誘導“交替啟用”抗炎 M2 表型 [5,6]₪▩✘₪•。為了響應對 M1 表型的刺激╃▩╃,已顯示巨噬細胞和小膠質細胞中發生代謝變化₪▩✘₪•。在 LPS 刺激期間╃▩╃,產生的一氧化氮 (NO) 會抑制氧化磷酸化╃▩╃,從而導致細胞轉為糖酵解₪▩✘₪•。由於這種反應╃▩╃,乳酸產量增加╃▩╃,這反過來又增加了細胞外酸化率 (ECAR)₪▩✘₪•。監測 pH 值的變化可以深入瞭解細胞和組織的生理和代謝狀態 [7]₪▩✘₪•。小膠質細胞的極化狀態通常可以透過基因表達••、細胞表面標誌物和釋放到培養基中或在細胞外基質中積累的蛋白質來檢測₪▩✘₪•。在這方面PCR••、流式細胞儀••、ELISA 和 Western Blotting 是尤為常見的方法之一╃▩╃,它們具有侵入性••、費力且耗時₪▩✘₪•。這些技術也不能提供關於極化狀態變化的洞察力和實時監測₪▩✘₪•。體外 實驗₪▩✘₪•。微流控晶片上的器官系統透過為異質細胞群提供具有動態培養模型的 3D 分層架構╃▩╃,提供了出色的體外 平臺來模擬複雜的器官/組織₪▩✘₪•。先前已經報道了具有複雜病因的疾病的神經炎症模型╃▩╃,這進一步突出了生物工程微環境的優勢[8]₪▩✘₪•。

材料與方法

微流控晶片由聚二甲基矽氧烷 (PDMS) 製成╃▩╃,因為它具有柔韌性╃▩╃,便於插入感測器插頭和密封洩漏₪▩✘₪•。為了製造晶片的 PDMS 元件╃▩╃,PDMS 分別用 1:10 的固化劑和 PDMS 混合物澆鑄在聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 模具上₪▩✘₪•。在真空下脫氣後╃▩╃,將模具在 80 ºC 下烘烤一小時╃▩╃,然後從模具中切出碎片₪▩✘₪•。晶片 A 是一種混合晶片╃▩╃,包括 PMMA 和 PDMS 元件₪▩✘₪•。晶片的底部包含一個用於 3D 培養和流體流動的通道╃▩╃,在這些層上帶有一個 PDMS 層╃▩╃,帶有入口••、出口和感測器插頭埠₪▩✘₪•。有一個額外的 PMMA 層包圍了晶片╃▩╃,為光纜提供結構支撐╃▩╃,從而促進螺栓的壓縮₪▩✘₪•。所有這些層都在 6 個螺栓的幫助下結合在一起(圖 1C)₪▩✘₪•。晶片 B 有兩層₪▩✘₪•。在軟光刻之後╃▩╃,將製造的 PDMS 元件等離子結合到顯微鏡載玻片上₪▩✘₪•。鍵合後╃▩╃,將這些晶片放置在 120°C 的熱板上 2 小時以增強鍵合強度₪▩✘₪•。

圖 1·₪☁↟│:用於 3D 和 2D 小膠質細胞極化的兩種不同製造的微流控晶片的影象₪▩✘₪•。用於 3D 細胞培養的晶片 A 的設計·₪☁↟│:A) AutoCAD 圖紙╃▩╃,尺寸以 [mm] 為單位╃▩╃,B) 晶片 A 從上到下的層數╃▩╃,C) 帶有藍色染料和感測器插頭假人的晶片 A 的影象╃▩╃,晶片 B 的設計用於2D 細胞培養·₪☁↟│:D) 晶片 B 的尺寸╃▩╃,E) 晶片 B 的層數╃▩╃,F) 帶有紅色染料和感測器插頭假人的晶片 B 的影象₪▩✘₪•。 N9小鼠小膠質細胞系用於巨噬細胞極化實驗₪▩✘₪•。使用完全 RPMI(無酚)培養基 1640(補充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青黴素/鏈黴素 (Pen/Strep))進行細胞擴增₪▩✘₪•。將細胞培養至 80% 融合並用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 收穫₪▩✘₪•。用高細胞密度 (4.5 x 10 5細胞/cm 2 )接種乙醇滅菌的晶片╃▩╃,並在靜態條件下在 37 °C 和 5% CO 2下孵育過夜₪▩✘₪•。

一旦小膠質細胞粘附並形成單層培養物╃▩╃,就使用注射泵(哈佛儀器)以 0.5 µl/min 的連續流量進行管理(圖 2)₪▩✘₪•。用 300 ng/ml 脂多糖 (LPS) 將小膠質細胞極化為 M1 樣表型 24 小時₪▩✘₪•。在整個研究過程中╃▩╃,未刺激的細胞用作對照組₪▩✘₪•。將微流控晶片放置在細胞培養箱中╃▩╃,並將感測器插頭連線到光纖電纜₪▩✘₪•。收集氧氣和 pH 感測器測量值 24 小時₪▩✘₪•。在資料採集過程中╃▩╃,沒有開啟培養箱以避免任何氣體和溫度波動₪▩✘₪•。

圖 2·₪☁↟│:實驗裝置·₪☁↟│:A) 連線到光纖儀表和計算機的感測器影象╃▩╃,B) 注射泵和晶片的影象╃▩╃,C) 培養箱內的晶片和連線的光纜₪▩✘₪•。

圖 2·₪☁↟│:實驗裝置·₪☁↟│:A) 連線到光纖儀表和計算機的感測器影象╃▩╃,B) 注射泵和晶片的影象╃▩╃,C) 培養箱內的晶片和連線的光纜₪▩✘₪•。

在微流控晶片中動態培養 24 小時後╃▩╃,將含有 15 µM 二硫蘇糖醇 (DTT) 的裂解緩衝液移液到通道中以裂解細胞₪▩✘₪•。收集裂解物並儲存在-80°C 用於 RNA 分離₪▩✘₪•。使用 Macherey-Nagel RNA 分離試劑盒分離 RNA₪▩✘₪•。透過 qPCR 分析根據其 TNFα••、IL-6 和 iNOS 基因表達水平比較對照組和 M1 組₪▩✘₪•。

在 24 小時孵育期間從微流控晶片出口收集的上清液用於 ELISA₪▩✘₪•。Affymetrix eBioscience 小鼠 TNFα 試劑盒已根據製造商說明使用₪▩✘₪•。為了驗證我們的感測器讀數並確認 M1 極化╃▩╃,我們確定了對照組和 M1 組釋放的 TNFα 水平₪▩✘₪•。

結果

溶解氧顯示 LPS 刺激的小膠質細胞和未刺激的對照組減少₪▩✘₪•。雖然在兩種情況下都有類似的趨勢╃▩╃,但在 24 小時的刺激期間╃▩╃,M1 極化小膠質細胞的氧水平低於對照₪▩✘₪•。對於 LPS 刺激的細胞╃▩╃,對照的溶解氧水平降低了 22.2% 和 29.5%(圖 3A)₪▩✘₪•。在 pH 監測晶片中╃▩╃,pH 水平在 24 小時內下降╃▩╃,其中對照的最終值為 6.8╃▩╃,LPS 刺激細胞的最終值為 6.5₪▩✘₪•。

圖 3·₪☁↟│:24小時刺激期間O 2和 pH 曲線的感測器資料₪▩✘₪•。A) 對照和 LPS 刺激細胞的 O 2 % 變化╃▩╃,B) 對照和 LPS 刺激細胞的 pH 變化₪▩✘₪•。

在 24 小時結束時對 TNFα••、IL-6 和 iNOS 的基因表達分析顯示了顯著的倍數變化╃▩╃,證實了動態微流體培養下 LPS 刺激的小膠質細胞的 M1 極化₪▩✘₪•。ELISA 測定表明從 LPS 刺激的細胞 (M1) 釋放的 TNFα 細胞因子顯著增加₪▩✘₪•。在動態條件下 24 小時後的 TNFα 濃度測量為未刺激的對照為 102 pg/ml╃▩╃,LPS 刺激的小膠質細胞為 470 pg/ml₪▩✘₪•。

圖 4·₪☁↟│:對照和 LPS 刺激細胞的 mRNA 表達₪▩✘₪•。A) 對照和 LPS 刺激細胞的 TNFα mRNA 表達╃▩╃,B) 對照和 LPS 刺激細胞的 IL-6 mRNA 表達╃▩╃,C) 對照和 LPS 刺激細胞的 iNOS mRNA 表達₪▩✘₪•。*P≤0.05╃▩╃,**P≤0.01╃▩╃,***P≤0.001₪▩✘₪•。P 值是從雙尾學生 t 檢驗計算的₪▩✘₪•。

圖 5·₪☁↟│:從對照和 LPS 刺激的晶片出口收集的培養基的 TNFα 濃度水平 (pg/ml)₪▩✘₪•。*P≤0.05╃▩╃,**P≤0.01╃▩╃,***P≤0.001₪▩✘₪•。P 值是從雙尾學生 t 檢驗計算的₪▩✘₪•。

討論

本研究的最初目的是觀察 3D 培養中極化過程中小膠質細胞發生的代謝變化₪▩✘₪•。為此╃▩╃,我們設計並製造了用於 3D 動態培養的晶片 A╃▩╃,並刺激細胞向 M1 表型發展₪▩✘₪•。我們觀察到╃▩╃,與 2D 培養相比╃▩╃,3D 培養中的細胞沒有有效極化₪▩✘₪•。我們得出結論╃▩╃,成功極化的細胞數量較少可能不足以改變整體代謝測量₪▩✘₪•。為了證明新型感測系統在微流體研究中的優勢╃▩╃,我們專注於更傳統的二維培養╃▩╃,並與文獻討論了結果₪▩✘₪•。因此╃▩╃,我們決定在微流控晶片內進行二維動態單層培養₪▩✘₪•。這些結果也促使我們將微流控晶片 A 改為晶片 B₪▩✘₪•。經過 24 小時的刺激╃▩╃,我們透過 qPCR 分析確保 M1 極化的成功₪▩✘₪•。典型 M1 狀態標誌物 TNFα••、IL-6 和 iNOS 的 mRNA 表達水平顯著高於對照組₪▩✘₪•。接下來╃▩╃,我們展示了受刺激的細胞實際上完成了從 mRNA 到蛋白質水平的翻譯過程₪▩✘₪•。為此╃▩╃,我們透過執行 ELISA 測定了微流控晶片出口處分泌的 TNFα 蛋白的水平₪▩✘₪•。

pH 變化與文獻一致·₪☁↟│:在之前的幾項研究中╃▩╃,M1 極化已被證明會導致 pH 水平降低╃▩╃,因為受刺激的細胞具有更高的 ECAR₪▩✘₪•。在我們的研究中╃▩╃,與對照晶片相比╃▩╃,我們能夠觀察到 LPS 刺激晶片內的 pH 值要低得多₪▩✘₪•。但是當我們檢視晶片的初始 pH 值時╃▩╃,它們是不同的₪▩✘₪•。這可能是由於微通道內的氣泡形成₪▩✘₪•。氣泡會影響晶片介質內的溶解氣體濃度╃▩╃,而溶解氣體會改變介質的 pH 值₪▩✘₪•。CO 2透過降低 pH 值來影響介質╃▩╃,另一方面╃▩╃,如果介質暴露於富含氧氣的氣體中╃▩╃,則介質的 pH 值會增加₪▩✘₪•。如果對照介質暴露於 O 2豐富的氣泡╃▩╃,這可以解釋較高的 pH 值₪▩✘₪•。這種差異還有另一種可能性₪▩✘₪•。設定實驗和開始測量大約需要 40 分鐘₪▩✘₪•。在測量開始之前將細胞暴露於刺激因子₪▩✘₪•。這可能是由於 LPS 刺激的細胞在刺激後透過 iNOS 的形成降低了培養基的 pH 值[7]₪▩✘₪•。

O 2水平與文獻不符·₪☁↟│:N9 小膠質細胞的 LPS 刺激降低了增殖率並改變了細胞代謝╃▩╃,使其成為糖酵解依賴性₪▩✘₪•。細胞代謝的這些變化導致耗氧量降低╃▩╃,並且由於細胞週期停滯 [9] 與相對較低的細胞數量相結合╃▩╃,LPS 刺激細胞的溶解氧水平測量值預計將高於對照╃▩╃,並且必須具有增加的趨勢24小時刺激₪▩✘₪•。我們的結果顯示 LPS 刺激細胞的氧水平降低了 7%₪▩✘₪•。必須進行更多的實驗以更好地理解為什麼會出現這種與文獻的分歧₪▩✘₪•。

 

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